蛋白磷酸化研究的預(yù)制膠
SuperSep Phos-tag?
SuperSep Phos-tag? 是研究蛋白磷酸化的方法，無需特異性磷酸化抗體或者同位素標(biāo)記。
◆SuperSep Phos-tag?
Phos-tag? 是一種預(yù)制膠，預(yù)先加入了 50 μmol/L 的 Phostag? Acrylamide，打開包裝即可直接使用。預(yù)制膠中含有鋅作為金屬離子，在中心凝膠緩沖液中保存穩(wěn)定性很好，得到的帶條結(jié)果也很整齊。
磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白作為不同條帶分離。
分離后，膠可用于考馬斯亮藍(lán)染色，免疫印跡和質(zhì)譜實驗。
◆Phos-tag? SDS-PAGE 的原理
◆在 HighWire Search 上搜索到的論文數(shù)
◆運(yùn)用
利用 p35 的丙氨酸突變體確定 Cdk5 激活 p35 的磷酸化位點
p35 常見的磷酸化位點是 Ser8 和 Thr138。但是 Ser8 和 Thr138 位點往往會發(fā)生丙氨酸突變，產(chǎn)生３種突變體（Ser8 突變體：S8A，Thr138 突變體：T138A，Ser8 和 Thr138 雙突變體：2A）。這３種突變體、野生型 p35、Cdk5 和沒有激酶活性的 Cdk5 都來源于 COS-7 細(xì)胞。這些細(xì)胞裂解液用Phos-tag? SDS-PAGE 和 Western blotting 進(jìn)行檢測（檢測抗體：p35 抗體）。
100 μM Phos-tag ? 丙烯酰胺, 7.5% 聚丙烯酰胺凝膠
可明確磷酸化位點和條帶遷移率的關(guān)系！
- 泳道１（條帶 L2 和 L4）和泳道５（條帶 M1）：p35 在 Cdk5 的作用下發(fā)生了磷酸化；
- 泳道１（條帶 L2 和 L4）和泳道３（條帶 L2 和 L4）：在無激酶活性 Cdk5 的作用下，大約有一半 p35 蛋白在 Thr138 位點發(fā)生磷酸化，同樣在 138 位發(fā)生突變的 p35 蛋白亦是如此。
- 泳道５ （條帶 M1）和泳道６（條帶 L3 和 L4）：Ser8 和 Thr138 是主要的磷酸化位點；
- 泳道５（條帶 M1）、泳道７（條帶L1和L2）和泳道８（條帶M2）：條帶 M1 是 Ser8 和T hr138 都發(fā)生磷酸化的條帶；
條帶 M2 是只有 Ser8 磷酸化的條帶；條帶 L1 和 L2 是只有 Thr138 磷酸化的條帶。
※ 條帶 L1 和 L3 中的Ｘ是不確定哪個位點發(fā)生磷酸化的條帶；
※ 條帶L4是非磷酸化的 p35 。
【參考文獻(xiàn)】
? Quantitative Measurement of in Vivo Phosphorylation States of Cdk5 Activator p35 by Phos-tag ? SDS-PAGE. T. Hosokawa, T. Saito, A. Asada, K. Fukunaga, and S. Hisanaga,Mol. Cell. Proteomics, Jun 2010;9: 1133 - 1143.
【結(jié)果提供】
理化學(xué)研究所 腦科學(xué)綜合研究中心 回路功能研究核心 記憶功能研究團(tuán)隊 細(xì)川智永（Dr. T. Hosokawa）
首都大學(xué)東京 理工學(xué)研究科 生命科學(xué)專業(yè) 神經(jīng)分子功能研究室 久永真市（Dr. S. Hisanaga）
檢測含有 Dnmt1 磷酸化激酶的片段
我們可以確定在片段中含有目的激酶！
① 采用親和色譜法從鼠腦提取液中純化 GST-Dnmt1（1-290）結(jié)合蛋白
② 使用 0.3 M 和 1 M NaCl 的 DNA 纖維素柱洗脫得到目的蛋白
③ GST-Dnmt1（1-290）作為體外激酶實驗的反應(yīng)底物
④ Phos-tag ? SDS-PAGE 用于Western blotting，確定遷移條帶中每個片段的激酶活性
【參考文獻(xiàn)】
The DNA-binding activity of mouse DNA methyltransferase 1 is regulated by phosphorylation with casein kinase 1delta/epsilon. Y. Sugiyama, N. Hatano, N. Sueyoshi, I. Suetake, S. Tajima, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike, and I. Kameshita, Biochem. J., May 2010; 427(3): 489-97.
【結(jié)果提供】
高知大學(xué) 綜合研究中心 生命、功能物質(zhì)部門 實驗實習(xí)機(jī)器設(shè)施 杉山康憲（Dr. Y. Sugiyama）
香川大學(xué) 農(nóng)學(xué)部 應(yīng)用生物科學(xué)科 動物功能生化學(xué)研究室 龜下勇（Dr. I. Kameshita）
二維電泳中的應(yīng)用：分析 hnRNP K 磷酸化異構(gòu)體
小鼠巨噬細(xì)胞 J774.1 經(jīng) LPS 刺激后，裂解細(xì)胞，經(jīng)過免疫沉淀法分離得到 hnRNP K。在二維電泳中，一維是 IPG 膠，二維是 Phos-tag ? SDS-PAGE，可分離 hnRNP K 的異構(gòu)體。利用質(zhì)譜儀，可以確認(rèn)不同的點代表不同的亞型或修飾蛋白。
同一個等電點的位置上，不同位點發(fā)生磷酸化都可以被區(qū)分開來
（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）
【參考文獻(xiàn)】
? Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics, Nov 2010; 10(21): 3884-95.
【結(jié)果提供】
橫濱市立大學(xué) 生命納米系統(tǒng)科學(xué)研究科 生物體超分子系統(tǒng)科學(xué)專業(yè) 木村彌生（Dr. Y. Kimura）、平野久（Dr. H. Hirano）
理化學(xué)研究所 RCAI 小原收
◆備注
樣品制備：
Phos-tag SDS-PAGE 對于蛋白樣品中的雜質(zhì)非常敏感，尤其是螯合劑，釩酸，無機(jī)鹽，表面活性劑這類物質(zhì)。
強(qiáng)烈建議在 Phos-tag SDS-PAGE 之前通過 TCA 沉淀或滲析法降低雜質(zhì)含量。
轉(zhuǎn)膜前處理：
另一個必須的步驟是在轉(zhuǎn)膜前，用 EDTA 去除凝膠中的金屬離子（Mn2+ 或者Zn2+）；該步驟可提高蛋白的轉(zhuǎn)膜效率。
● 分別準(zhǔn)備 10 mmol/L 含 EDTA 和不含 EDTA 兩種 1x transfer buffer。
● 將凝膠浸泡在含 10 mmol/L EDTA 的 1x transfer buffer，至少 20 分鐘，溫和搖晃。更換新緩沖液，重復(fù)３次。
● 將凝膠浸泡在不含 10 mmol/L EDTA 的 1x transfer buffer，10 分鐘，溫和搖晃。
● 轉(zhuǎn)膜操作*。
* 建議用濕法轉(zhuǎn)膜，以提高轉(zhuǎn)膜效率。
◆質(zhì)量控制
每一批 SuperSep Phos-tag?，出廠前均根據(jù)其產(chǎn)品規(guī)格進(jìn)行測試，以保證可分離磷酸化和非磷酸化蛋白，以及他們的分離成都在正常參數(shù)內(nèi)。
◆保存溫度
2-10℃
◆產(chǎn)品信息
用于 Bio-Rad 伯樂電泳儀
貨號 | 品名 | 電泳儀 | 規(guī)格 |
SuperSep? Phos-tag? (50μmol/L), 7.5%, 17well, 83×100×3.9mm | Mini-PROTEAN? Tetra Cell (Bio-Rad Laboratories, Inc.) | 5 塊 | |
SuperSep? Phos-tag? (50μmol/L), 12.5%, 17well, 83×100×3.9mm | 5 塊 |
用于 Life Technologies 電泳儀
貨號 | 品名 | 電泳儀 | 規(guī)格 |
SuperSep? Phos-tag? (50μmol/L), 7.5%, 17well, 100×100×6.6mm | XCell SureLock? Mini-Cell (Life Technologies, Inc.) | 5 塊 | |
SuperSep? Phos-tag? (50μmol/L), 12.5%, 17well, 100×100×6.6mm | 5 塊 |
用于 Wako EasySeperator 電泳儀
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品 | 凝膠濃度 | 孔數(shù) | 包裝 |
| 192-17401 | SuperSep? Phos-tag? (50 μmol/L) Phos-tag? 預(yù)制膠50 μmol/L | 6.0% | 13孔 | 5塊 |
| 199-17391 | 6.0% | 17孔 | 5塊 | |
| 195-17371 | 7.5% | 13孔 | 5塊 | |
| 192-17381 | 7.5% | 17孔 | 5塊 | |
| 193-16711 | 10.0% | 13孔 | 5塊 | |
| 190-16721 | 10.0% | 17孔 | 5塊 | |
| 195-16391 | 12.5% | 13孔 | 5塊 | |
| 193-16571 | 12.5% | 17孔 | 5塊 | |
| 193-16691 | 15.0% | 13孔 | 5塊 | |
| 196-16701 | 15.0% | 17孔 | 5塊 | |
| 197-16851 | 17.5% | 13孔 | 5塊 | |
| 194-16861 | 17.5% | 17孔 | 5塊 |
◆相關(guān)產(chǎn)品
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
| 058-07681 | EasySeparator Phos-tag預(yù)制凝膠的配套電泳槽 | 1 set |
細(xì)胞分析
細(xì)胞治療
外泌體研究
生殖工程
新藥研發(fā)&生物工藝
細(xì)胞培養(yǎng)
疾病研究
蛋白研究
轉(zhuǎn)染
藥物篩選
藥理毒理
干細(xì)胞研究
表觀遺傳學(xué)
分子生物學(xué)
植物學(xué)
微生物學(xué)
耗材
生物活性物質(zhì)
其他
產(chǎn)品中心 > 生命科學(xué) > 蛋白研究 > 磷酸化蛋白
SuperSep Phos-tag? 預(yù)制膠
SuperSep Phos-tag?
蛋白磷酸化研究的預(yù)制膠
SuperSep Phos-tag?
SuperSep Phos-tag? 是研究蛋白磷酸化的方法，無需特異性磷酸化抗體或者同位素標(biāo)記。
◆SuperSep Phos-tag?
Phos-tag? 是一種預(yù)制膠，預(yù)先加入了 50 μmol/L 的 Phostag? Acrylamide，打開包裝即可直接使用。預(yù)制膠中含有鋅作為金屬離子，在中心凝膠緩沖液中保存穩(wěn)定性很好，得到的帶條結(jié)果也很整齊。
磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白作為不同條帶分離。
分離后，膠可用于考馬斯亮藍(lán)染色，免疫印跡和質(zhì)譜實驗。
◆Phos-tag? SDS-PAGE 的原理
◆在 HighWire Search 上搜索到的論文數(shù)
◆運(yùn)用
利用 p35 的丙氨酸突變體確定 Cdk5 激活 p35 的磷酸化位點
p35 常見的磷酸化位點是 Ser8 和 Thr138。但是 Ser8 和 Thr138 位點往往會發(fā)生丙氨酸突變，產(chǎn)生３種突變體（Ser8 突變體：S8A，Thr138 突變體：T138A，Ser8 和 Thr138 雙突變體：2A）。這３種突變體、野生型 p35、Cdk5 和沒有激酶活性的 Cdk5 都來源于 COS-7 細(xì)胞。這些細(xì)胞裂解液用Phos-tag? SDS-PAGE 和 Western blotting 進(jìn)行檢測（檢測抗體：p35 抗體）。
100 μM Phos-tag ? 丙烯酰胺, 7.5% 聚丙烯酰胺凝膠
可明確磷酸化位點和條帶遷移率的關(guān)系！
- 泳道１（條帶 L2 和 L4）和泳道５（條帶 M1）：p35 在 Cdk5 的作用下發(fā)生了磷酸化；
- 泳道１（條帶 L2 和 L4）和泳道３（條帶 L2 和 L4）：在無激酶活性 Cdk5 的作用下，大約有一半 p35 蛋白在 Thr138 位點發(fā)生磷酸化，同樣在 138 位發(fā)生突變的 p35 蛋白亦是如此。
- 泳道５ （條帶 M1）和泳道６（條帶 L3 和 L4）：Ser8 和 Thr138 是主要的磷酸化位點；
- 泳道５（條帶 M1）、泳道７（條帶L1和L2）和泳道８（條帶M2）：條帶 M1 是 Ser8 和T hr138 都發(fā)生磷酸化的條帶；
條帶 M2 是只有 Ser8 磷酸化的條帶；條帶 L1 和 L2 是只有 Thr138 磷酸化的條帶。
※ 條帶 L1 和 L3 中的Ｘ是不確定哪個位點發(fā)生磷酸化的條帶；
※ 條帶L4是非磷酸化的 p35 。
【參考文獻(xiàn)】
? Quantitative Measurement of in Vivo Phosphorylation States of Cdk5 Activator p35 by Phos-tag ? SDS-PAGE. T. Hosokawa, T. Saito, A. Asada, K. Fukunaga, and S. Hisanaga,Mol. Cell. Proteomics, Jun 2010;9: 1133 - 1143.
【結(jié)果提供】
理化學(xué)研究所 腦科學(xué)綜合研究中心 回路功能研究核心 記憶功能研究團(tuán)隊 細(xì)川智永（Dr. T. Hosokawa）
首都大學(xué)東京 理工學(xué)研究科 生命科學(xué)專業(yè) 神經(jīng)分子功能研究室 久永真市（Dr. S. Hisanaga）
檢測含有 Dnmt1 磷酸化激酶的片段
我們可以確定在片段中含有目的激酶！
① 采用親和色譜法從鼠腦提取液中純化 GST-Dnmt1（1-290）結(jié)合蛋白
② 使用 0.3 M 和 1 M NaCl 的 DNA 纖維素柱洗脫得到目的蛋白
③ GST-Dnmt1（1-290）作為體外激酶實驗的反應(yīng)底物
④ Phos-tag ? SDS-PAGE 用于Western blotting，確定遷移條帶中每個片段的激酶活性
【參考文獻(xiàn)】
The DNA-binding activity of mouse DNA methyltransferase 1 is regulated by phosphorylation with casein kinase 1delta/epsilon. Y. Sugiyama, N. Hatano, N. Sueyoshi, I. Suetake, S. Tajima, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike, and I. Kameshita, Biochem. J., May 2010; 427(3): 489-97.
【結(jié)果提供】
高知大學(xué) 綜合研究中心 生命、功能物質(zhì)部門 實驗實習(xí)機(jī)器設(shè)施 杉山康憲（Dr. Y. Sugiyama）
香川大學(xué) 農(nóng)學(xué)部 應(yīng)用生物科學(xué)科 動物功能生化學(xué)研究室 龜下勇（Dr. I. Kameshita）
二維電泳中的應(yīng)用：分析 hnRNP K 磷酸化異構(gòu)體
小鼠巨噬細(xì)胞 J774.1 經(jīng) LPS 刺激后，裂解細(xì)胞，經(jīng)過免疫沉淀法分離得到 hnRNP K。在二維電泳中，一維是 IPG 膠，二維是 Phos-tag ? SDS-PAGE，可分離 hnRNP K 的異構(gòu)體。利用質(zhì)譜儀，可以確認(rèn)不同的點代表不同的亞型或修飾蛋白。
同一個等電點的位置上，不同位點發(fā)生磷酸化都可以被區(qū)分開來
（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）
【參考文獻(xiàn)】
? Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics, Nov 2010; 10(21): 3884-95.
【結(jié)果提供】
橫濱市立大學(xué) 生命納米系統(tǒng)科學(xué)研究科 生物體超分子系統(tǒng)科學(xué)專業(yè) 木村彌生（Dr. Y. Kimura）、平野久（Dr. H. Hirano）
理化學(xué)研究所 RCAI 小原收
◆備注
樣品制備：
Phos-tag SDS-PAGE 對于蛋白樣品中的雜質(zhì)非常敏感，尤其是螯合劑，釩酸，無機(jī)鹽，表面活性劑這類物質(zhì)。
強(qiáng)烈建議在 Phos-tag SDS-PAGE 之前通過 TCA 沉淀或滲析法降低雜質(zhì)含量。
轉(zhuǎn)膜前處理：
另一個必須的步驟是在轉(zhuǎn)膜前，用 EDTA 去除凝膠中的金屬離子（Mn2+ 或者Zn2+）；該步驟可提高蛋白的轉(zhuǎn)膜效率。
● 分別準(zhǔn)備 10 mmol/L 含 EDTA 和不含 EDTA 兩種 1x transfer buffer。
● 將凝膠浸泡在含 10 mmol/L EDTA 的 1x transfer buffer，至少 20 分鐘，溫和搖晃。更換新緩沖液，重復(fù)３次。
● 將凝膠浸泡在不含 10 mmol/L EDTA 的 1x transfer buffer，10 分鐘，溫和搖晃。
● 轉(zhuǎn)膜操作*。
* 建議用濕法轉(zhuǎn)膜，以提高轉(zhuǎn)膜效率。
◆質(zhì)量控制
每一批 SuperSep Phos-tag?，出廠前均根據(jù)其產(chǎn)品規(guī)格進(jìn)行測試，以保證可分離磷酸化和非磷酸化蛋白，以及他們的分離成都在正常參數(shù)內(nèi)。
◆保存溫度
2-10℃
◆產(chǎn)品信息
用于 Bio-Rad 伯樂電泳儀
貨號 | 品名 | 電泳儀 | 規(guī)格 |
SuperSep? Phos-tag? (50μmol/L), 7.5%, 17well, 83×100×3.9mm | Mini-PROTEAN? Tetra Cell (Bio-Rad Laboratories, Inc.) | 5 塊 | |
SuperSep? Phos-tag? (50μmol/L), 12.5%, 17well, 83×100×3.9mm | 5 塊 |
用于 Life Technologies 電泳儀
貨號 | 品名 | 電泳儀 | 規(guī)格 |
SuperSep? Phos-tag? (50μmol/L), 7.5%, 17well, 100×100×6.6mm | XCell SureLock? Mini-Cell (Life Technologies, Inc.) | 5 塊 | |
SuperSep? Phos-tag? (50μmol/L), 12.5%, 17well, 100×100×6.6mm | 5 塊 |
用于 Wako EasySeperator 電泳儀
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品 | 凝膠濃度 | 孔數(shù) | 包裝 |
| 192-17401 | SuperSep? Phos-tag? (50 μmol/L) Phos-tag? 預(yù)制膠50 μmol/L | 6.0% | 13孔 | 5塊 |
| 199-17391 | 6.0% | 17孔 | 5塊 | |
| 195-17371 | 7.5% | 13孔 | 5塊 | |
| 192-17381 | 7.5% | 17孔 | 5塊 | |
| 193-16711 | 10.0% | 13孔 | 5塊 | |
| 190-16721 | 10.0% | 17孔 | 5塊 | |
| 195-16391 | 12.5% | 13孔 | 5塊 | |
| 193-16571 | 12.5% | 17孔 | 5塊 | |
| 193-16691 | 15.0% | 13孔 | 5塊 | |
| 196-16701 | 15.0% | 17孔 | 5塊 | |
| 197-16851 | 17.5% | 13孔 | 5塊 | |
| 194-16861 | 17.5% | 17孔 | 5塊 |
◆相關(guān)產(chǎn)品
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
| 058-07681 | EasySeparator Phos-tag預(yù)制凝膠的配套電泳槽 | 1 set |
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品等級 |
| 193-16711 | SuperSep Phos-tag? (50 μmol/L), 10%, 13 well Phos-tag 13孔10%預(yù)制膠 | 5塊 | - |
| 190-16721 | SuperSep Phos-tag? (50 μmol/L), 10%, 17 well Phos-tag 17孔10%預(yù)制膠 | 5塊 | - |
| 195-16391 | SuperSep Phos-tag? (50 μmol/L), 12.5%, 13 well Phos-tag 13孔12.5%預(yù)制膠 | 5塊 | - |
| 193-16571 | SuperSep Phos-tag? (50 μmol/L), 12.5%, 17 well Phos-tag 17孔12.5%預(yù)制膠 | 5塊 | - |
| 193-16691 | SuperSep Phos-tag? (50 μmol/L), 15%, 13 well Phos-tag 13孔15%預(yù)制膠 | 5塊 | - |
| 196-16701 | SuperSep Phos-tag? (50 μmol/L), 15%, 17 well Phos-tag 17孔15%預(yù)制膠 | 5塊 | - |
| 197-16851 | SuperSep Phos-tag? (50 μmol/L), 17.5%, 13 well Phos-tag 13孔17.5%預(yù)制膠 | 5塊 | - |
| 194-16861 | SuperSep Phos-tag? (50 μmol/L), 17.5%, 17 well Phos-tag 17孔17.5%預(yù)制膠 | 5塊 | - |
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0731-84321919
